威尼德分子雜交儀：Western 中NC膜、PVDF膜、尼龍膜的差別

       硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)，NC膜在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到，雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結(jié)合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小。膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20000的蛋白選用0.45um的膜，小于20000的蛋白選用0.2um的膜。PVDF膜使用是需預處理，用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結(jié)合。PVDF膜具有較高的機械強度，是印跡法中的理想固相支持物材料。

尼龍膜是一種合成的長鏈聚酰胺薄膜，對核酸和蛋白質(zhì)具有很強的結(jié)合能力，能代替硝酸纖維素薄膜用于分子印跡和雜交實驗。NC膜、PVDF膜、尼龍膜的差別：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用廣的一種固相支持物，價格便宜；PVDF膜介于二者之間。

1. 就結(jié)合能力而言：

尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。

2. 就溫度適應(yīng)性而言：

尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜脆，易破碎；PVDF膜較強。

3. 就重復性而言：

（1）尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。

（2）NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復清洗的用途。因為經(jīng)不起多次“折磨"。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結(jié)合力會有所降低。

（3）由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%(據(jù)說0.05%效果好)。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。

（4）與 硝 酸 纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機械強度和化學相容性上都更*的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2(而結(jié)合強度PVDF比硝纖膜強6倍！)。但是PVDF膜最大的優(yōu)點不僅于此：更好的機械強度和化學耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測序，在相當“嚴酷"的清洗條件下，當尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，所以PVDF也是要做蛋白測序的選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡，才能用。